INTRODUCTION

Les mycobactéries sont des bactéries mal colorées par coloration de Gram et bien colorées par la coloration de Ziehl-Neelsen où elles apparaissent rouges sur fond bleu. Elles sont phylogénétiquement classées parmi les bactéries Gram-positives à haut GC %. Il s'agit d'un genre bactérien extrèmement polymorphe qui comporte des mycobactéries à croissance rapide (moins de 7 jours pour produire des colonies visibles), des mycobactéries à croissance lente (7-60 jours pour produire des colonies visibles) et une espèce non-cultivée en dehors des animaux, Mycobacterium leprae, agent de la lèpre. L'analyse basée sur la séquence du gène 16S ARNr permet de décrire les principaux groupes de mycobactéries. Egalement, le pouvoir pathogène va de la simple contamination jusqu'aux infections mortelles telles que la tuberculose due aux espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis. De nombreuses espèces nouvelles ont été décrites depuis dix ans à partir de l'utilisation de nouvelles techniques moléculaires d'identification basées sur le séquençage de gènes appropriés. Certaines espèces sont responsables d'infections émergentes ayant l'eau comme source de contamination.

QUELS SONT LES RESERVOIRS DES MYCOBACTERIES INFECTANT L'HOMME

Concernant la tuberculose, l'homme est le seul réservoir connu pour M. tuberculosis et la contamination résulte d'une ihnalation de goutelettes de Pflügge contaminées. La source est représentée par un patient présentant une tuberculose pulmonaire bacillifère. Les autres formes cliniques de la tuberculose ne sont pas contagieuses. Egalement, l'ingestion de produits laitiers non-pasteurisés peut être un mode de contamination à partir de bovins atteints de tuberculose bovine. Concernant la lèpre, le mode de contamination est mal connu. L'homme est le seul réservoir connu de Mycobacterium leprae et la contamination se fait par inhalation de gouttelettes contaminées à partir d'un patient présentant une rhinite lépreuse. L'eau est le principal réservoir des autres mycobactéries, il s'agit des eaux douces naturelles ainsi que des eaux traitées domestiques et hospitalières. En particulier, les eaux des piscines et spas, des réseaux hospitaliers, des fontaines réfrigérantes et des machines à glace ont été montrées comme contaminées par les principales espèces de mycobactéries. La contamination se fait par inoculation après une plaie traumatique ou une plaie chirurgicale utilisant de l'eau contaminée ou un instrument rincé avec une eau contaminée, ou par inhalation notamment dans le cadre des explorations endoscopiques des voies aériennes. Mycobacterium marinum est transmis par voie percutanée à partir d'eau douce et d'eau saumâtre et provoque le «granulome des piscines».

QUELLES SONT LES MANIFESTATIONS CLINIQUES DES INFECTIONS PAR LES MYCOBACTERIES ?

La tuberculose est une maladie systémique dont l'agent Mycobacterium tuberculosis est persistant dans l'organisme après la contamination (primo-infection). La primo-infection peut être asymptomatique et révélée uniquement par l'apparition d'une réaction cutanée aux tests tuberculiniques. Sinon, elle se manifeste sous forme d'une pneumonie préférentiellement des lobes supérieurs des poumons, associée à des expectorations hémoptoïques et une altération de l'état général avec amaigrissement. Tous les autres organes et tissus peuvent ensuite être le site de l'infection et se manifester sous forme de méningite et encéphalite, pleurésie, péricardite, atteinte péritonéale et atteinte osseuse essentiellement. La tuberculose vertébrale est également appelée mal de Pott. La lèpre due à Mycobacterium leprae se manifeste par une rhinite atrophique à laquelle succède après plusieurs années d'évolution, des multinévrites responsables de troubles trophiques et d'amputations spontanées. Les autres espèces de mycobactéries sont responsables d'infections cutanées granulomateuses (Mycobacterium marinum après contact avec les poissons et coquillages; Mycobacterium fortuitum lors de soins de beauté), d'infection des voies aériennes et de pneumonie (Mycobacterium avium chez les patients immunodéprimés, Mycobacterium abscessus chez les patients mucoviscidosiques; Mycobacterium kansasii et patients immunodéprimés) et d'infections nosocomiales de site opératoire (Mycobacterium xenopi).

QUELS SONT LES ECHANTILLONS A PRELEVER EN CAS DE SUSPICION D'INFECTION A MYCOBACTERIES ?

Il convient de prélever le tissus siège de l'infection. Pour la tuberculose pulmonaire, il convient de recueillir trois expectorations le matin à jeun, trois jours consécutifs. Pour les autres localisations, il convient de réaliser une ponction de liquide pathologique (épanchement péricardique, pleural, ascite) ou bien une biopsie. Le recueil des échantillons est réalisé dans un récipient stérile ne contenant aucun liquide de fixation ni aucun liquide de transport (récipient sec). L'heure de recueil de l'échantillon doit être indiquée. Le transport au laboratoire doit être réalisé dans les 4 heures, à défaut il convient de placer l'échantillon à 4°C dans l'attente de son transport. La demande doit mentionner la recherche de mycobactéries.

QUELS SONT LES ELEMENTS BIOLOGIQUES DE DIAGNOSTIC SPECIFIQUE

Examen direct. L'examen direct est réalisé après coloration de Ziehl et permet d'apprécier la qualité de l'échantillon (présence relative de polynucléaires neutrophiles et de cellules épithéliales par exemple en cas d'expectoration) et de détecter la présence de bacilles alcoolo-acido-résistants caractéristiques des mycobactéries.

Isolement et culture. Bien que les ouvrages de référence indiquent que les mycobactéries cultivent sur des milieux spécifiques (milieu de Löwenstein, milieu de Middelbrook), nous avons montré que la gélose à 5% de sang de mouton qui est un milieu utilisé en routine dans le laboratoire permet l'isolement et la culture des principales espèces de mycobactéries . Cependant, il est fonctionnel d'utiliser des automates d'incubation utilisant le bouillon Middlebrook. Il est possible de distinguer les espèces à croissance rapide qui produisent des colonies visibles en moins de 7 jours, des espèces à croissance lente qui cultivent en 1-6 semaines. Mycobacterium leprae ne cultive pas en dehors d'animaux expérimentalement infectés (tatou à neuf bandes, coussinet plantaire de souris SCID). Les échantillons cliniques naturellement stériles sont ensemencés directement, les échantillons cliniques naturellement contaminés doivent être décontaminés avant inoculation. Pour le cas particulier du liquide céphalo-rachidien, il convient de centrifuger 10 mL et d'inoculer le culot de centrifugation; en cas de volume insuffisant, l'inoculation de 1 mL sur cultures cellulaires par la technique de centrifiugation en tube bijou est une alternative possible.

Identification moléculaire. L'identification des souches de mycobactéries est basée sur quelques caractères phénotypiques de base (temps de croissance des colonies, aspect des colonies, coloration de Ziehl, catalase) et sur l'identification moléculaire. Celle-ci peut être réalisée par l'utilisation de sondes d'hybridation commercialisées détectant des régions spécifiques du gène 16S ARNr, ou par l'utilisation de sondes LightCycler basées sur le gène rpoB ou bien encore sur le séquençage de ce gène. Il est possible de réaliser une identification moléculaire des mycobactéries visualisées après coloration de Ziehl directement dans les échantillons cliniques, par contre il n'y a pas actuellement de système de détection moléculaire dans les échantillons Ziehl négatifs qui ait des valeurs prédictives suffisantes pour être utilisé en routine.

Typage des souches. Il est possible de réaliser le typage moléculaire des souches de Mycobacterium tuberculosis. Les méthodes actuelles reposent toutes sur l'analyse d'un profil caractéristique obtenu après électrophorèse de produits d'amplification des Mycobacterial Interspred Repetitive Elements (MIRU) ou de régions variables Variable Number of tandem Repeats (VNTR). Il existe des bases de données informatisées accessibles par Internet permettant de comparer rapidement le profil obtenu avec une souche. Le typage permet de relier une souche à l'un des groupes génétiques actuellement reconnus et contribue à explorer les cas groupés de tuberculose y compris lorsque les données épidémiologiques de base sont peu évocatrices, les réinfections des réactivations et à reconnaître les contaminations de laboratoire.

Antibiogramme. Il est utile de réaliser un antibiogramme pour Mycobacterium tuberculosis par mise en culture en présence des antibiotiques à tester. Il est possible de réaliser une détection moléculaire de la résistance à la rifampicine par amplification/séquençage du gène rpoB. Il n'y a pas d'évidence de l'intérêt clinique des antibiogrammes pour les autres espèces de mycobactéries.

L'INTERPRETATION DES RESULTATS

Il convient d'interpréter les résultats de laboratoire concernant la recherche des mycobactéries. Il existe des faux négatifs liés à la présence préalable d'antibiotiques, à la mauvaise qualité des prélèvements ou un délai d'inoculation supérieur à 4 heures. Il existe également des faux positifs de détection par coloration de Ziehl liés à la présence de mycobactéries dans les colorants et par culture par contaminations croisées et le pourcentage de faux positifs dans un laboratoire est estimé à 1-3%. Par ailleurs, il convient d'interpréter un résultat positif en fonction de l'espèce de mycobactérie. Mycobacterium tuberculosis est toujours pathogène mais les autres espèces peuvent être de simples contaminants des prélèvements ou de simplement en situation de colonisation. Pour les espèces non-tuberculeuses, il est recommandée de disposer de trois prélèvements positifs en l'absence de tout autre pathogène pour retenir le rôle pathogène des mycobactéries.

QUELLE EST LA CONDUITE A TENIR EN CAS DE DIAGNOSTIC DE TUBERCULOSE ?

Isolement du patient.

La tuberculose pulmonaire bacillifère (examen direct d'une expectoration ou d'un autre prélèvement des voies aériennes positif) est une maladie contagieuse qui impose l'isolement du patient en chambre seule avec mise en place d'un isolement de type respiratoire. Cet isolement doit être maintenu jusqu'à obtenir trois prélèvements successifs en trois jours négatifs.

Traitement du patient.

Le traitement des différentes formes cliniques de tuberculose repose sur l'administration à posologies adaptées de médicaments antituberculeux dont la rifampicine, l'izoniazide, l'éthambutol et la pyrazinamide. La durée du traitement est variable en fonction de la forme clinique mais comprise entre 6-12 mois. D'autres familles de médicaments antibiotiques peuvent être prescrites en deuxième ligne en cas d'infection par une souche résistante aux antituberculeux de première ligne.

Déclaration.

La tuberculose est une maladie à déclaration obligatoire anonymisée auprès du médecin de la Direction Départementale des Affaires Sanitaires et Sociales (DDASS). La déclaration peut être établie par le médecin traitant et le médecin biologiste, les doublons sont automatiquement éliminés par le médecin de la DDASS.

QUELLES SONT LES CONTRIBUTIONS DE L'IFR 48 SUR LE SUJET ?

Isolement et culture des mycobactéries.

Les laboratoires de la Fédération de Microbiologie Clinique et l'Unité des Rickettsies ont contribué à mettre au point des méthodes d'isolement et culture de Mycobacterium tuberculosis et M. avium-intracellular sur gélose au sang, sur culture cellulaire par la méthode du shell-vial assay et par co-culture d'amibes. La position intracellulaire de Mycobacterium ulcerans a été monté par la même approche. Cette approche a permis de préciser la prévalence des mycobactéries dans le cadre des lymphadénopathies.

Figure 1. Ziehl-Neelsen staining of Mycobacterium tuberculosis isolated from the cerebrospinal fluid of a patient with tuberculous meningitis, using the shell-vial assay.

Identification des mycobactéries à croissance rapide.

Nous avons également développé des outils moléculaires pour l'identification et la phylogénie des mycobactéries à croissance rapide par analyse de la séquence du gène rpoB.

Description de nouvelles espèces et d'infections émergentes.

Cette approche a permis la description de 6 nouvelles dans le cadre des infections émergentes à mycobactéries.

Epidémiologie de la tuberculose à Marseille.

Nous avons réalisé une analyse de l'épidémiologie de la tuberculose dans notre ville dont les éléments sont présentés dans les documents ci-après.

Figure 1. Distribution de l'âge des patients présentant une tuberculose documentée, selon le sexe, entre le 1er janvier 1998 et le 31 décembre 2001.

Figure 2. Taux d'incidence pour 100.000 personne-années des arrondissement de la ville de Marseille, concernant les cas de tuberculose déclarés entre le 1er janvier 1998 et le 31 décembre 2001.

Table 1. Espèces émergentes du genre Mycobacterium décrites dans l'IFR 48;

ESPECES	Source	Date	Référence
Mycobacterium barrassiae	Clinique	2006	Adekambi T et al. J. Clin. Microbiol. 2006 ; 44:3493-8.
Mycobacterium conceptionense	Clinique	2006	Adekambi T. et al. J. Clin. Microbiol. 2006; 44:1268-73.
Mycobacterium bolletii	Clinique	2006	Adekambi T. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56:133-43.
Mycobacterium phocaicum	Clinique	2006	Adekambi T. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56:133-43.
Mycobacterium aubagnense	Clinique	2006	Adekambi T. et al. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56:133-43.
Mycobacterium massiliense	Clinique	2004	Adekambi T. et al. J. Clin. Microbiol. 2004; 42:5493-501.

Références :

1. Adékambi T, Drancourt M. rpoB gene-sequence-based depictering emerging non-tuberculous mycobacteria with description of Mycobacterium bolletii sp. nov., Mycobacterium aubagnense sp. nov., and Mycobacterium phoceae sp. nov. Int J Syst Evolut Microbiol. 2005 (in press).
2. Adekambi T, Reynaud-Gaubert M, Greub G, Gevaudan MJ, La Scola B, Raoult D,
3. Drancourt M. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. J Clin Microbiol. 2004 ;42:5493-501.
4. Adekambi T, Colson P, Drancourt M. rpoB-based identification of nonpigmented and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol. 2003 ;41:5699-708.

LISTE DES PUBLICATIONS DE L'IFR 48 SUR LE SUJET

1. Adékambi T, Drancourt M. rpoB gene-sequence-based depictering emerging non-tuberculous mycobacteria with description of Mycobacterium bolletii sp. nov., Mycobacterium aubagnense sp. nov., and Mycobacterium phoceae sp. nov. Int J Syst Evolut Microbiol. 2005 (in press).
2. Adekambi T, Reynaud-Gaubert M, Greub G, Gevaudan MJ, La Scola B, Raoult D,
3. Drancourt M. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. J Clin Microbiol. 2004 ;42:5493-501.
4. Adekambi T, Drancourt M. Dissection of phylogenetic relationships among 19 rapidly growing Mycobacterium species by 16S rRNA, hsp65, sodA, recA and rpoB gene sequencing. Int J Syst Evol Microbiol. 2004 ;54:2095-105.
5. Berger P, Lepidi H, Drogoul-Vey MP, Poizot-Martin I, Drancourt M. Mycobacterium avium brain abscess at the initiation of highly active antiretroviral therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2004 ;23:142-4.
6. Adekambi T, Colson P, Drancourt M. rpoB-based identification of nonpigmented and late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol. 2003 ;41:5699-708.
7. Drancourt M, Carrieri P, Gevaudan MJ, Raoult D. Blood agar and Mycobacterium tuberculosis: the end of a dogma. J Clin Microbiol. 2003 ;41:1710-1.
8. Drancourt M, Jarlier V, Raoult D. The environmental pathogen Mycobacterium ulcerans grows in amphibian cells at low temperatures. Appl Environ Microbiol. 2002 ;68:6403-4.
9. Fournier PE, Drancourt M, Lepidi H, Gevaudan MJ, Raoult D. Isolation of mycobacteria from clinical samples using the centrifugation-shell vial technique. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000 ;19:69-70.
10. Stein A, Purgus R, Drancourt M, Olmer M. Photo quiz. Diagnosis: cutaneous miliary tuberculosis. Clin Infect Dis. 1999 ;29:1126-7; quiz 1307-8.
11. Stein A, Purgus R, Drancourt M, Olmer M. Answer to photo quiz (see pages 1126-7) Clin Infect Dis. 1999 ;29:1307-8.
12. Jacomo V, Musso D, Gevaudan MJ, Drancourt M. Isolation of blood-borne Mycobacterium avium by using the nonradioactive BACTEC 9000 MB system and comparison with a solid-culture system. J Clin Microbiol. 1998 ;36:3703-6.

CONSULTATIONS AU SEIN DE L'IFR 48

Professeur Michel DRANCOURT

Professeur Philippe BROUQUI

Professeur Andréas STEIN

CORRESPONDANTS AU SEIN DE L'IFR 48

Professeur Michel DRANCOURT