INTRODUCTION
La définition des virus remonte au XIXème siècle. En effet, la découverte et l'utilisation du microscope a permis à partir de la moitié du XIXème siècle de confirmer la théorie des germes. Dans cette théorie, un certain nombre de maladies contagieuses allaient trouver une explication par la constatation qu'elles étaient associées régulièrement à des microbes visibles et cultivables. De cette époque héroïque d'où émergent les noms de L. Pasteur en France et de R. Koch en Allemagne, date la découverte d'un grand nombre de bactéries. A côté de ces bactéries, susceptibles de se multiplier dans des milieux artificiels, sont aussi découverts des eukaryotes unicellulaires eux aussi, microscopiques, mais possédant un noyau, comme les cellules humaines, tel que l'agent du paludisme découvert par A. Lavéran et les levures (champignons microscopiques) dont le rôle de ferment du vin fut identifié par Pasteur. La recherche à cette époque extraordinaire permet d'expliquer de nombreuses maladies de l'homme, des animaux et des plantes. Toutefois le microscope ne suffit pas à expliquer l'ensemble des maladies transmissibles. C'est ainsi que pour la rage, Pasteur montre que l'on peut transmettre d'animal à animal (chez le lapin) un principe infectieux qui n'est pas visible au microscope. Plus encore ce principe infectieux est filtrable et même ultrafiltrable, c'est à dire que l'on peut le passer à travers des filtres très fins en conservant sa virulence. Ceci vaut à ces agents invisibles au microscope le nom d'ultravirus qui sera dérivé ensuite en virus. Ceci montre que la définition historique du virus est basé sur le fait qu'il n'est pas observable au microscope car il est trop petit (la limite visible au microscope est de 0.2 à 0.4 microns) et que sa petite taille lui permet d'être filtré alors que les bactéries ne le sont pas. Ainsi se met en place une classification des agents infectieux (Figure 1) avec d'une part les prokaryotes (bactéries) qui n'ont pas de noyaux, les eukaryotes qui comprennent un certain nombre d'êtres unicellulaires mais aussi multicellulaires (les champignons macro et microscopiques, les mammifères, les oiseaux, les vers et les arthropodes).
La définition des prokaryotes va évoluer parce qu'il va être noté qu'il existe (comme toujours) des exceptions et que certains prokaryotes ont en fait un noyau et une membrane nucléaire. Par ailleurs, à partir de 1970 les analyses génétiques réalisées par C. Woese montrent que les prokaryotes sont divisés en deux mondes celui des bactéries et celui des Archae. Il s'agit de microorganismes ressemblant physiquement aux bactéries mais très distincts génétiquement qui s'appellent les Archae (Figure 2). Ces prokaryotes vivent souvent dans des conditions extrêmes et ont un équipement génétique qui est équidistant entre les bactéries et les eukaryotes. Ceci a amené dès lors à considérer qu'il existait trois domaines de la vie bien définis, les Archae, les bactéries et les eukaryotes. Pour les virus, leur rattachement à ces domaines de la vie ne fait pas l'unanimité. On trouve toutefois des virus dans les trois mondes du vivant connu que sont les bactéries, les Archae et les eukaryotes.
ORIGINE DES VIRUS
L'origine des virus et leur définition a fait l'objet de discussions très animées pendant les années 50. Deux points de vues extrêmes se sont exprimés. Burnet (qui était aussi un rickettsiologue), considérait que les virus étaient des microorganismes parasites qui évoluaient en réduisant leur taille et leur génome du fait de leur parasitisme. En effet, leurs besoins diminuaient au fur et à mesure de leur parasitisme et les gènes inutiles s'éliminaient de ce fait. A l'inverse, Stanley (prix Nobel de biochimie) en étudiant le virus de la mosaïque du tabac a montré qu'il s'agissait en réalité d'une association de molécules. Pour lui les virus étaient des molécules biologiques parasites et non pas des êtres vivants. Dans une tentative de réconciliation et pour définir les virus, Lwoff (prix Nobel français) a tenté une définition consensuelle, en 1957, qui sert encore de référence (Figure 3). Pour lui, un virus a une petite taille (une de ces dimensions doit être inférieure à 250 manomètres), ne possède qu'un type d'acide nucléique (ARN ou ADN), ne possède pas d'enzymes capables de produire de l'énergie, est incapable de se multiplier par division binaire, et est un parasite intracellulaire obligatoire. Il faut noter que la définition purement moléculaire des virus vient aussi de recevoir une démonstration spectaculaire avec un travail récent de Craig Wenter qui a réussi à synthétiser entièrement un virus in vitro, (au laboratoire) puis à l'inoculer et à montrer qu'il était capable d'auto-réplication malgré son origine artificielle.
La taille des virus et leur vie comme parasite est extraordinairement variable. Le plus petit d'entre eux, l'agent Delta n'est capable de se multiplier qu'en présence d'un autre virus, le virus de l'hépatite B, à l'intérieur d'une cellule eukaryote (Figure 4). C'est donc un parasite de virus. Il ne comporte qu'un seul gène. A l'inverse, les gros virus à ADN comporte plusieurs centaines de gènes. Il existe ainsi une variation importante de la taille du génome des virus. Ceci est associé assez naturellement à une différence de taille des virus. Enfin, il existe globalement une grande division parmi les virus, ceux qui ont de l'ADN et ceux qui ont de l'ARN.
ORIGINE DES VIRUS
Les virus à ADN ont fait l'objet de nombreux travaux récents pour tenter de découvrir leur origine. Certains scientifiques pensent qu'ils ont une origine commune et qu'ils représentent une branche évolutive des êtres vivants. Deux approches ont été utilisées pour tenter cette démonstration. La première mise en place par Koonin a été de tenter d'identifier, chez les gros virus à ADN, un ensemble de gènes communs. Si on arrive en effet à montrer que les virus actuels ont tous en commun un certain nombre de gènes, ceci ne peut pas être lié au hasard et traduit une origine unique. Il a ainsi défini un ensemble de 57 gènes communs à deux ou plus, familles virales, et a pu identifier 9 gènes communs à tous les gros virus à ADN actuellement séquencés. Ceci permet de réaliser un arbre des virus à ADN et montre que les différentes familles de ces virus ont des liens sans toutefois retrouver la racine de leur origine. En effet, ces gènes ne permettent pas de donner d'une manière significative un raccord avec les 3 autres domaines du vivant que sont les bactéries, les eukaryotes et les Archae.
Une deuxième approche a été réalisée grâce à la structure de la capside. Ce qui définit un virus morphologiquement est l'existence d'une capside, c'est-à-dire d'une tuile protéique susceptible de s'assembler pour constituer un volume géométrique souvent de type icosahédrique. Cette forme est radicalement différente de celle des autres êtres vivants. L'étude des protéines de ces capsides et l'étude des gènes les codant n'a pas permis de montrer une conservation suffisante pour postuler une origine commune de tous ces virus. En revanche, l'analyse structurale (tridimensionnelle) a permis de montrer que la capside des virus d'Archae, de bactéries et d'eukaryotes, présentait des motifs entièrement conservés qui ne pouvaient pas être le fruit du hasard. A partir de ces éléments, Rossman et coll. puis Benson et coll. ont postulé que les protéines de la capside avaient une origine commune chez tous les virus actuels. Ceci laissait supposer que l'origine des virus était unique et plongeait à la naissance des trois grands domaines de la vie. L'hypothèse devenait que c'est la spécialisation des virus à leur hôte qui les a amenés à diverger. C'est dans ce contexte et dans ce débat que nous avons commencé à travailler avec Mimivirus.
LES RICKETTSIOLOGUES
Les rickettsiologues sont des chercheurs qui travaillent depuis le début du XXème siècle sur des organismes atypiques qui se présentent comme de petites bactéries mais qui ont les conditions de culture des virus. En pratique, ce sont des bactéries intracellulaires strictes. Un grand débat a d'ailleurs eu lieu pendant les années 50 et 60 pour savoir à quel domaine appartenaient les rickettsies qui regroupaient un groupe hétérogène, les Chlamydia et les mycoplasmes. Ils étaient considérés comme intermédiaires entre virus et bactéries. Parmi ces micro-organismes, certains sont extrêmement pathogènes et ont causé des épidémies chez l'homme. Ces bactéries sont mal colorables par les techniques habituelles de coloration de bactéries, elles sont petites, certaines sont filtrables (une forme de Coxiella burnetii passe à travers les filtres de 0,20 micromètres), toutefois l'étude biochimique, puis génétique, de ces organismes a confirmé qu'elles représentaient plusieurs branches à l'intérieur du monde des bactéries. Il s'agit de bactéries qui sont devenues parasites exclusifs. En se spécialisant, elles ont réduit leur taille et celle de leur génome en abandonnant des fonctions qu'elles sont susceptibles de prendre chez leur hôte. Les rickettsiologues ont donc spontanément comme attitude de penser que les virus sont une autre forme parasitaire du vivant, ayant eu une évolution réductive comme on peut le voir chez les rickettsies, mais plus intense. On peut voir aussi cette forme de réduction évolutive chez les Archae, et Noarcheum est le plus petit prokaryote : son génome est de 400 kilobases. De même que chez les eukaryotes, il existe des parasites intra-cellulaires de petite taille. Ainsi Encephalitozoon a un génome de 2,4 MB.
LA DECOUVERTE DE MIMIVIRUS
Comme rickettsiologue, je me suis spécialisé dans l'identification des bactéries difficiles. En particulier, des bactéries intracellulaires. Pour ce faire, nous utilisons depuis le début des années 90, des techniques moléculaires permettant d'obtenir des séquences de gènes universels chez les bactéries. Le plus utilisé est le gène universel de l'ADN qui code pour l'ARN du ribosome utilisé par C. Woese pour définir les bactéries. Grâce à cette technique, nous avons pu décrire de très nombreuses bactéries. Cette technique a été utilisée pour pouvoir identifier une collection de bactéries intracellulaires, se multipliant dans des amibes de l'eau. Cette collection avait été constituée par un chercheur anglais, Robowtham, qui était à la recherche de Légionella. Cette bactérie qui détermine la maladie des légionnaires, vit en effet dans l'eau, à l'intérieur des amibes. Certaines des Legionella qu'il trouvait (en faisant des enquêtes pour chercher la source d'épidémie de pneumonie) n'étaient pas susceptibles d'être cultivées autrement que dans les amibes, (à la différence de Legionella pneumophila), l'agent de la maladie du légionnaire. Il avait appelé cette collection de bactéries, les Légionella associées aux amibes. En 1992, il avait isolé à Bradford, une de ces «bactéries» qui était colorée comme une bactérie par la coloration de Gram (mais curieusement Gram positif) et dont l'identification n'avait pas été faite. Un étudiant anglais (R. Birtles) après sa thèse est venu faire un stage post-doctoral de trois ans dans mon laboratoire et il a apporté la collection de Robowtham, qui venait de partir à la retraite, pour l'identifier avec nos méthodes. Ceci a permis l'identification et la description de nouvelles espèces de Legionella (nous les avons baptisé Legionella falloni, Legionella robowthami et Legionella drancourti). De manière surprenante, et pour la première fois, une nouvelle branche de Chlamydia a été aussi identifiée. Elle est appelée depuis Parachlamydia acantamoebae et est l'agent de rares pneumonies chez l'homme. La dernière bactérie, appelée Bradford coccus a résisté à nos techniques d'identification. Richard Birtles est retourné en Angleterre et nous avons continué à tenter d'identifier cette bactérie. J'ai eu l'idée de regarder au microscope électronique, pour la première fois, avant et après la procédure d'extraction des acides nucléiques, car je pensais que nos techniques n'étaient pas suffisamment agressives et que nous n'arrivions pas à détruire la paroi de ces bactéries. Nous avons eu la grande surprise, (voir photo) de voir qu'en réalité, ce que nous prenions pour une bactérie avait la forme d'un virus géant, avec une structure icosahedrique tout à fait typique d'un virus. Il était simplement en diamètre deux fois et demi plus gros que les plus gros virus connus; les Irridovirus qui sont des virus de plantes (Figure 5). Avec mon collaborateur, Bernard La Scola, nous avons démontré qu'il s'agissait bien d'un virus, car il était incapable de division binaire. Il présentait une éclipse typique des virus. Cette éclipse définit le cycle viral dans lequel on voit le virus entier rentrer dans la cellule, disparaître et réapparaître en nombreuses copies. Mimivirus réapparaît à la surface du noyau de l'amibe. Nous avons mis en évidence que son génome était essentiellement constitué d'ADN. Il s'agit donc d'un gros virus à ADN. Ultérieurement, nous avons pu montrer que, de manière surprenante, il présentait aussi des ARN. Par ailleurs, quand nous avons étudié le contenu protéique de Mimivirus, nous avons été surpris de voir qu'il présentait plusieurs centaines de protéines dans le virion. Au total, nous étions bien devant un virus dont la dimension n'avait plus rien à voir avec la taille des virus connus. Une des choses qui a le plus surpris le monde scientifique, c'est que ce virus soit susceptible d'être coloré par la coloration de Gram, et visible au microscope. (Mimivirus vient de Mimiking Microbe). Il a été appelé ainsi pour reconnaître qu'il avait imité un microbe pendant longtemps.
LE SEQUENCAGE DE MIMIVIRUS
Nous avons entrepris avec l'équipe de Jean-Michel Claverie, au CNRS, à Marseille, de séquencer et d'annoter le génome de Mimivirus. Nous avions eu l'expérience, ensemble, du séquençage et de l'annotation de deux génomes bactériens, Rickettsia conorii et Tropheryma whipplei. Le séquençage a été réalisé dans mon laboratoire sous la direction de Catherine Robert. La fermeture de la molécule a été réalisée sur le plan bioinformatique avec l'aide de Stéphane Audic, du laboratoire de Jean-Michel Claverie. L'annotation a été réalisée par Jean-Michel Claverie et Hiro Ogata. Le premier élément de surprise est que le génome de Mimivirus mesure presque 1,2 millions de bases. C'est un génome énorme. Il est plus gros que celui de 25 bactéries déjà séquencées, il est plus gros que celui d'une Archae déjà séquencée. Enfin, sa taille n'est que la moitié de celui du génome du plus petit Eukaryote connu. Ainsi, de par sa taille et de par son génome, Mimivirus a une situation comparable à celle des Prokaryotes et de quelques Eukaryotes. Le contenu de ce génome est intéressant. Ainsi, Mimivirus présente plus de 1200 séquences qui apparemment sont codantes (gènes). Parmi ces gènes, plus de 200 sont reconnaissables et peuvent être l'objet d'une identification de leur fonction putative. Ce niveau d'information n'avait jamais été obtenu pour un virus. Ainsi, de nombreux gènes ont été trouvés pour la première fois dans un virus grâce à Mimivirus. Parmi les éléments les plus troublants, nous avons trouvé de nombreux gènes associés à la traduction des ARN en protéines. En règle générale, les virus ne possèdent pas tels gènes, car étant toujours parasites, ils utilisent la machinerie de leur hôte pour la traduction. Chez Mimivirus, au contraire, plusieurs gènes associés à la traduction sont présents, et en particulier, des acides aminés t.RNA synthétases. Chantal Abergel, dans le laboratoire de Jean-Michel Claverie, a pu réaliser la synthèse d'une de ses protéines et montrer qu'elle avait une activité parfaitement normale. Ainsi, ces gènes apparaissent fonctionnels et servent à Mimivirus, bien qu'on ne comprenne pas pourquoi il a besoin de telles fonctions dans sa vie entièrement parasite. Il faut toutefois remarquer, quand l'on compare Mimivirus aux microorganismes de taille équivalente, que sa capacité de traduction est faible. La traduction est en effet l'élément le plus conservé chez les autres êtres vivants. Les séquençages des génomes bactériens d'Archae et d'Eukaryote ont montré qu'il existait un ensemble limité de gènes présents chez tous les êtres vivants. En tout, 63 gènes seulement sont présents chez tous. Parmi les 63, plus des deux tiers sont directement liés à la traduction. Ainsi on peut dire que la partie qui n'est jamais (pour autant que l'on sache) susceptible de disparaître dans les trois domaines de la vie actuellement connus concernent la traduction. D'une manière très intéressante, Mimivirus possédant beaucoup plus d'informations que les autres virus, présente aussi 7 gènes communs à l'ensemble des autres êtres vivants, qui allaient nous permettre de tenter d'enraciner l'origine de Mimivirus au milieu des autres êtres vivants.
MIMIVIRUS PARMI LES AUTRES VIRUS
Mimivirus possède 42 des 57 gènes de l'ensemble des gènes communs des gros virus à ADN dont les 9 déjà communs à l'ensemble des autres virus (Figure 6). Ceci confirme bien que Mimivirus ne soit pas d'une nature radicalement différente des autres gros virus à DNA. Il fait partie de cette lignée, mais en constitue toutefois une famille séparée. L'étude phylogénique suivante a permis d'utiliser les 7 gènes communs entre Mimivirus et les autres êtres vivants pour constituer un arbre de la vie en enchaînant ces différents gènes pour avoir une information suffisamment fiable. Nous avons pu voir ainsi se créer un arbre non pas à trois branches, (tel qu'il était connu avant le travail sur Mimivirus), mais à quatre branches. En effet, à côté des trois domaines déjà connus, Mimivirus représente une 4ème branche proche de l'origine des Eukaryotes (Figure 7). Les arbres qui s'enracinent à une telle distance (nous estimons cette origine à 4 milliards d'années) présentent une incertitude, quant à leur branchement réel. C'est à dire que le branchement que nous observons sur les Eukaryotes est peut être lié à un phénomène connu qui s'appelle l'attraction des longues branches. Quoiqu'il en soit, Mimivirus, effectivement émerge d'un 4ème domaine de la vie, distinct des Eukaryotes et des Prokaryotes. En tant que tel, il vient démontrer que la conservation de la capside est aussi associée à une spécificité évolutive qui témoigne vraisemblablement que les virus à ADN ont une origine commune avec des évolutions divergentes, les virus étant devenus plus ou moins petits en fonction de leur niche évolutive.
LA REDEFINITION DES VIRUS
Mimivirus remet en cause la définition des virus de plusieurs points de vue. Premièrement, il a une taille qui dépasse celle que l'on attendait. Deuxièmement, il possède de l'ARN et de l'ADN. Il avait été démontré en 1998 que les Cytomegalovirus aussi possèdent de l'ADN et de l'ARN, et que donc le dogme (d'un seul type d'acide nucléique par virus) n'était pas totalement exact. Il est parasite intracellulaire (mais il y a d'autres microorganismes chez les Archae, les Eukaryotes et les bactéries qui sont aussi des intracellulaires stricts). En revanche, la division binaire, n'est pas observée et il n'existe pas vraiment de gènes codants pour des enzymes susceptibles de fournir directement de l'énergie. La comparaison des virus, dont Mimivirus, aux êtres vivants, montre que ce qui n'a jamais été retrouvé chez les virus, c'est le ribosome et les protéines du ribosome. Incontestablement, ceci constitue une ligne de démarcation très nette entre les virus et les autres êtres vivants. Une autre découverte importante chez Mimivirus est le nombre de gènes dits orphelins, c'est à dire codant théoriquement pour des protéines qui sont inconnues. Nous avons pu noter que certaines de ces protéines étaient exprimées en étudiant les protéines de Mimivirus. Ceci signifie que ces gènes ont eu une vie propre qui remonte peut être à des milliards d'années, et qu'ils constituent des protéines dont l'usage nous est actuellement parfaitement inconnu. Si l'on réalise que 80% des gènes tombent dans cette catégorie, on comprend le degré de méconnaissance des protéines virales et de leur fonction que nous avons pour l'instant. Enfin, il n'apparaît pas que Mimivirus ait importé récemment de gènes des autres domaines du vivant. Ceci remet aussi en cause une vision des virus qui sont souvent considéré comme des sacs de gènes et comme les rois du transfert latéral de gènes. Mimivirus, apparemment, n'importe pas plus de gènes que les bactéries intracellulaires strictes et plutôt moins que les bactéries avec lesquelles nous sommes le plus familiers comme Escherichia coli. Ainsi, Mimivirus par sa taille extraordinaire permet de remettre en cause une vision simplifiée de ce que sont les virus et de relancer le débat sur l'existence d'un quatrième domaine de la vie, entièrement parasitaire.
Bibliographie
- Woese C.The universal ancestor. Proc. Natl.Acad.Sci.USA 1998; 95:6854-9
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